崇祯十二年，李自成经过三年的准备和恢复，再次举兵攻明。转战陕甘、河南一带，在河南李自成斩杀明朝的万安王。与当地农民军首领顺利会师，部众发展到数十万人之多。后李自成率军连战连捷，攻克宜阳，取得卢氏。李自成在转战的过程中，先后有许多有知识的人加入，如对李自成产生了重要影响的牛金星、李岩等人就是在这一时期加入李自成的起义军的，并很快成为心腹谋士。后来李自成采纳李岩的建议提出了“均田免粮”的口号，“迎闯王，不纳粮”，李自成的起义军得到劳苦大众的一致拥护。崇祯十四年春，李自成在城内守军的策应下攻陷洛阳，杀死了民愤极大的福王朱常洵。不久李自成又率军围开封，数攻不克，转战邓州，击杀明朝总督傅宗龙。崇祯十五年，李自成与罗汝才以20万的部队再围开封，激战20余日未能攻克，但却回师攻破河南襄城，俘斩明总督汪乔年和降明的农民军首领李万庆。继而攻克陈州，与当地农民军会合，返师第三次围开封。先歼灭出城突袭的三营明军，后连破郑州、荥阳、上蔡，扫清开封周围明军据点。明督师丁启睿、总兵左良玉率师十余万挺进朱仙镇。李自成以部分兵力继续围城，率主力占领朱仙镇有利地形迎击明军，获得大胜，俘虏明军数万人。崇祯十六年正月，李自成攻克襄阳，提出了“三年不征，一民不杀”口号，李自成被拥为奉天倡义文武大元帅。随后，李自成采纳谋士顾君恩计策，制定先取关中、再攻山西、后取北京的作战方略。亲自率大军北上河南，在汝州之战中歼灭明军4万余人，迫使孙传庭败逃陕西。乘势追击，尽歼镇守潼关的明军，击杀孙传庭，占领潼关、西安等地。随即分兵追歼明军残部，连下延安、汉中、榆林诸重镇。
崇祯十七年正月，李自成建立大顺政权，年号永昌，李自成称大顺王，改西安为西京。随后李自成率军强渡黄河，攻进山西境内，攻克太原。然后，李自成兵分两路，一部由大将刘芳亮率领攻河北，自己同大将刘宗敏率主力部队北上宁武关，从北面迂回围攻北京，李自成率领大军顺利攻下大同、宣府、昌平。于三月十七日攻到北京城下，此时，明朝的崇祯皇帝已经无军可调，守城的都是一些老弱病残的兵士。崇祯急调山海关总兵吴三桂和江南明军率兵勤王。但是已经为时已晚，三月十九日，李自成率军攻破了北京城，崇祯帝朱由检在万念俱灰，自缢于煤山之上。
李自成在攻陷北京之后，开始被胜利冲昏了头脑。这些农民出身的起义军将领以为攻陷了北京，除掉了明朝的皇帝，就是大功告成，可以坐享天下了。李自成和刘宗敏等人也都开始忙于修建宫室，搜罗美女，对明朝的官员进行追赃。他们没有及时的追剿依然据有江南的几十万明军，也忽视了重兵在握的山海关总兵吴三桂。起初的时候，李自成还想招降吴三桂。但是，由于义军将领在追赃的过程中，致使吴三桂的父亲吴襄自杀殉国，更让他不能忍受的是，自己心爱的宠妾陈圆圆也被义军大将刘宗敏抢了过去。吴三桂一怒之下投降了清朝的多尔衮，打开城门引兵入关。四月十三日，李自成率军十万讨伐吴三桂。两军在山海关前的一片石接战，这真是一场恶战！只见狂风大作，飞沙走石遮蔽天日。李自成的大顺军和吴三桂的军队在风沙之中展开一场不辨敌手的血战。霎时间，金鼓之声，呐喊之声传到百里之外。在农民军层层包围之下，吴三桂率军左冲右突，拼命死战。双方苦战了大半日，到下午时分，吴三桂几乎要支撑不住了。就在他精疲力竭，即将崩溃的时候。多尔衮的八旗铁骑突然从乱石之间杀了出来，大顺军虽然奋勇拼杀，与清军苦战半日。但最终还是在两军的围攻之下落败。大将军刘宗敏中箭负伤，损兵数万。李自成被迫急令撤退，清军乘胜追击，一直追出四十多里开外，获得许粮草骡马无数。
山海关之战后，李自成退回北京。由于主力遭到重大伤亡，李自成不得不作出放弃北京退守关中的战略决策。二十九日，李自成在太和殿称帝，第二天便率军撤出了北京，挥师西进，据关中以抗清军。十月，多尔衮率军入关，顺治帝定鼎燕京之后，马上抽调八旗劲旅攻剿李自成。为了彻底消灭李自成的几十万大军，多尔衮命英亲王阿济格为靖远大将军，率军八万西讨李自成。旋即又命豫亲王多铎率部下精兵与之合剿。
在清军和明朝降兵的合击之下，李自成的大顺军节节败退。一直退到了陕西潼关，潼关之战，大顺军再次失利，被迫退出陕西，转战河南、湖北。准备夺取东南作为抗清基地，但是清军却对大顺军紧逼不放。派出重兵节节阻击，南明政权的明军也顺势攻击大顺军。导致李自成在湖北武昌、阳新、江西九江接连失利，东下的去路也被切断。后来，李自成率军到达九宫山一带，此后便失去了踪迹。几十万的大顺军也像蒸发似的，一下子就没了。关于李自成最终的结局，后人提出了许多不同的看法。
其中一种最具代表性说法是李自成在九宫山被地主团练攻杀。提出这种说法的最主要的依据是清朝靖远大将军阿济格给朝廷的奏报和南明王朝驻湘将领兵部尚书何腾蛟给唐王的报告。阿济格的奏报中称：“李自成兵尽力尽，仅带亲信20人，窜入九宫山中，被村民围困，无法脱逃，自缢而死。”他派人前去验尸，而尸体已经腐烂，无法辨认。何腾蛟给唐王的报告也称，自己的部众将李自成斩于九宫山下，只是丢了首级。但是，这两个说法似乎都存在许多可疑之处，令人难以尽信。因为李自成是一位“万金之赏莫能购，十道之师莫能征”的军事奇才，不仅骁勇异常，而且还很有谋略。他的生死对清王朝或南明王朝统治者来说都是一个很重要的问题。但在阿济格和何腾蛟的报告都存在模糊之处。阿济格的奏报中说李自成的尸体“尸朽莫辨”，何腾蛟的报告中则称尸体无头。也就是说两位将领都没有亲自看到死得这个人就是李自成。而是根据别人的报告，臆断这就是李自成，便急忙上了折子功请赏。特别值得一提的是，李自成退居湖湘时，手下尚有40余万兵马，驻九宫山一带的至少也有数万人，绝非奏报中所称的仅带20名亲信。况且，如果李自成真的被杀，他的几十万大军岂能善罢甘休？九宫山能平静吗？然而，事实上，当时九宫山很平静，那几十万大军也很平静。也就是说，李自成遇难九宫山说，要么是两位将领为了邀功请赏而造出来的，要么是这是李自成与其部下故意施放的烟幕弹。用李自成以死作缓兵之计。这样一方面，可以打消南明王朝对这支大军的敌意;另一方面，也可以缓解清军对他的攻击。以便可以等待时机成熟时东山再起。
另外一种比较流行的说法是，李自成没有死，而是在夹山寺出家做了和尚。这一说法，最早见于《澧州志林》的记载，书中说李自成兵败之后并没有死，而是跑到了湖南的石门夹山寺出家做了和尚，法号丰天玉。后来这个人便到夹山寺探访，寺中一位七十多岁的老和尚还记的夹山寺过去的事情，告诉他奉天玉和尚是顺治初年入寺的，声音像是西北的人。他还在寺中他亲眼见过一幅李自成的画像。1981年，在石门夹山寺发现了奉天玉大和尚墓。据考查，在一个瓷坛中盛的遗骨，与李自成身材相近。墓中陪葬物与李自成家乡陕西米脂县的习俗相同。此后，考古人员又在夹山寺“敕印”的石龟和“奉天玉诏”铜牌，“敕”和“诏” 字都是皇帝的专用名词，由此可见，这个奉天玉极有可能就是做过皇帝的李自成。但对这一说法也有人持有异议。他们认为，奉天玉大和尚的墓和其他文物的发现，只能说明石门夹山寺确实有奉天玉大和尚这个人，但并不能证明奉天玉大和尚就是李自成。李自成生前左眼曾受箭伤失明，《澧州志林》中描述的李自成画像却双目炯炯有神，与事实不符。李自成在夹山寺出家一说，也还有待商榷。
近来又有人对李自成的生死提出更新的说法，认为李自成兵败后，没有出家做和尚，也没有在九宫山遇难，而是辗转来到粤北乐昌的金城山。在这里继续从事抗清斗争，后来因叛徒出卖而受伤，死于马背之上。当然，以上的三种说法，都各有一定道理，但都是一家之言，并非定论。事实如何，也许永远也弄不明白。
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